从Ulvbbrmoricana中提取的

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摘要

用绿海藻为原料，制备了海藻硫化多糖（MSP）提取液和在家畜中发现的42种细菌菌株分离物进行抑菌试验。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长均受到影响。最敏感的病原体是多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、猪丹毒丝菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌，其最小抑菌浓度（MIC）范围为0.16～6.2mg/ml。肠球菌、停乳链球菌、棒状杆菌、化脓隐秘菌和支气管败血波氏杆菌也对MSP敏感，MIC值为25和50mg/ml时记录到完全抑制。用体外分化的猪肠上皮细胞系（IPEC-1）评估提取物对宿主肠道免疫应答介质的刺激作用。RT-qPCR分析显示IL1α,IL1β,L6,IL8,TNFα,等细胞因子及趋化因子CCL20的mRNA表达显著增加。该提取物还显著诱导配体激活的转录因子PPARγ、和TLR2受体的表达。

关键字

绿藻，Ulvaarmoricana，硫化多糖，抗菌活性，肠上皮细胞，细胞因子

简介

几十年来，在家畜饲料中不加选择地过度使用抗生素作为生长促进剂，造成了持续的选择压力。这促进了耐药菌株的发展，并导致欧盟完全禁止使用抗菌生长促进剂。需要能够替代刺激先天免疫反应和限制家畜感染的预防策略。海洋藻类是自然界中生长最快的植物有机体，具有生产生物活性化合物的能力，可应用于制药、化妆品、食品和动物饲料等行业（OSullivan等人年；JiménezEscrig等人。年；Lee等人年）。对海藻的营养研究表明，绿色、棕色和红色海藻具有良好的营养特性，可作为膳食纤维、蛋白质、维生素和矿物质的替代来源（Chojnacka等人。年；Raposo等人年）。此外，对微藻和大型藻类功能的详细筛选，发现其具有抗凝血、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节等多种生物学活性。所有这些都可能与营养功能食品有关（Wijesekara等人年；Lee等人年；Fedorov等人年）。藻类的生物活性成分包括蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素、多酚、矿物质、维生素和多糖（Ngoa等人年；福克纳年）。事实上，绿藻、褐藻和红藻细胞壁分别含有大量硫化多糖，分别称为绿藻硫化多糖、岩藻多糖和卡拉胶，其含量在干重的4%到76%之间（Holdt等人，年；Wijesinghe等人年；Ferreira等人年）。这些硫化多糖的含量很高，拥有独特的结构和生物学特性为有前景的应用天然药物和膳食产品提供了新的线索（Rioux等人。年；Laurienzo等人年）。在绿海藻(石莼属和浒苔属)中发现的绿藻硫化多糖是水溶性酸性衍生物和硫化多糖，其主要成分为硫酸盐、鼠李糖、木糖、糖醛酸和葡萄糖醛酸(Lahayeetal.)。体外和体内研究表明，绿藻硫化多糖与岩藻多糖和卡拉胶一样，具有广泛的生物活性，如抗菌和免疫调节特性（Wijesekara等人，年；Silva等人年；Fedorov等人年）。最近，从土耳其采集的几种绿藻和英国淡水中分离出的含有天然提取物的绿藻硫化多糖(Orhanetal.)和(AbdEl-Bakyetal.;Spavierietal.)。此外，从主要从韩国采集的绿藻中纯化的绿藻硫化多糖也显示出免疫调节活性，可能在刺激免疫反应或控制炎症过程中有潜在的应用价值(Chenetal.;Naetal.;Kimetal.;Karnjanapratumetal.;Tabarsaetal.)。评价藻类多糖免疫特性的研究主要是利用巨噬细胞样细胞系的原代培养(Chenetal.;Jaswiretal.)。然而，尽管巨噬细胞是先天免疫必不可少的效应细胞，但是肠上皮细胞也很重要，因为它们表达模式识别受体(PRRs)，使它们能够作为微生物环境和外来抗原的动态传感器。因此，它们通过产生广泛的涉及相邻免疫细胞激活的介质，积极参与粘膜免疫的协调(Artisetal.;Miron等人;Peterson等，)。

在布列塔尼海岸（法国）采集的海洋藻类的潜在抗菌活性尚未进行深入研究（Hellio等人.年；年；年；Zubia等人.)。他们调节免疫反应的能力从未被研究过。本研究的目的是评估从布列塔尼海岸（法国）采集的Ulvaarmoricana水提取物对从受感染的农场动物中分离出的42株病原体的抗菌活性。此外，利用从猪肠道的肠上皮细胞系IPEC-1的体外系统评估宿主肠道免疫反应介质的刺激（GanzalezVallina等人年）。作为饲料添加剂，这种海藻硫化多糖（MSP）提取物可能会构成一种新的预防策略，以提高家畜的肠道健康，从而减少后续抗生素治疗的使用。

材料和方法

01

藻源及MSP提取物的制备

年6月，在法国布雷塔涅（Bretagne；48°39′28〃N，3°37′47〃W）的PlestinlesGrèves海滩采集到绿潮藻Ulvasp.。藻类在淡水中被清洗，排干，然后深度冷冻。作为一个工业过程的一部分，藻类被解冻，湿磨，液相和固相被分离。液体通过切向过滤（TamiIndustries，Nyons，France）进行分馏，并集中在单效浓缩器（EVA，Pignat，Genas，France）上。滤液通过冷冻干燥（ChristAlpha1–4LSC，FisherScientific，France）进行干燥，冷冻干燥后的材料使用珠磨机（Minimill，Philips，France）研磨成粉末，每碗两个锆碗和四个锆珠。

02

成分分析

采用以下方法检查提取物成分，一式三份。在°C下焚烧样品6小时后，用重量法测定灰分值。元素百分比分析（C、H、N、S和O）由CNRS的中央微量分析部门（France，GifSurYvette），根据制造商的建议使用元素分析系统GmbHVarioElIII元素分析仪（HANAU,Germany)。这种分析系统可以评估所有有机物和大多数无机物中的碳、氮、硫、氢和氧。简而言之，毫克量的样品在氦载气中高温燃烧（C、H、N和S）或热解（O）。可测量气体（二氧化碳、水、氮气、二氧化硫或一氧化碳）在色谱柱上分离。燃烧产物根据已知的参考标准通过非色散红外吸收检测系统进行定量测量，但通过热导率检测器(TC)测定的氧除外。中性糖测定采用苯酚-硫酸法测定，以无水D-葡萄糖为标准（0-μg/ml）（Dubois等人）。采用间羟基二苯法测定糖醛酸（Blumenkrantz等人）。多糖中存在的硫酸盐基团的量通过天青A法（Sigma-Aldrich，法国）测定，使用17%的硫酸葡聚糖作为0至μg/ml范围内的标准（Jaques等人，年）。在℃条件下，用3M/LMeOH/HCl对MSP样品进行酸解4h，然后用Montreuil等人的方法对三甲基硅基衍生物进行气相色谱（GC）分析，测定单糖的摩尔比（）。肌醇（1mg/ml）作为内参照物，氮气作为载体气体，采用HP-5MS型非极性色谱柱（30m，内径0.25mm）进行分析。温度曲线编程如下：°C持续1分钟，然后在叠氮化物之间以0.5ml/min的流速梯度1.5°C/min。使用串联的Shodex和柱以及用于检测的多角度光散射折射计（Wyatt，18个角度），dn/dc为0.ml/g。

03

抗菌活性测定

菌株和培养条件MSP提取物对42株革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的抗菌活性进行了研究。其中39例是年至年间从受感染的农场动物的临床材料中分离出来的，并保存在国际病原菌资源中心（CIRM-BP，INRA-UMRISP，法国努兹利）。巴氏杆菌·杀禽亚种及巴氏杆菌·多杀亚种。巴氏杆菌(n°3和4)是从哥德堡大学的文化收藏中获得的，而单核增生李斯特菌EGDe则是由PhilippeVelge(INRAValdeLoire,Nouzilly,France)提供的。表1显示了不同的菌株和分离物、它们的CIRM-BP参考号和它们的分离来源。在37°C的脑心灌注（BHI）培养基中，将不需要特殊营养补充剂（如大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌、粘质沙雷氏菌和肺炎克雷伯菌）等非挑剔菌株在37°C的条件下培养过夜，然后在BHI琼脂平板或血琼脂上分离葡萄球菌菌株的菌落。其余生长缓慢、挑剔的的菌株在含有5%GibcoHorse血清的BHI培养基（法国ThermoFisherScientific）中37°C预培养过夜，然后在血琼脂平板上分离菌落。

表1本研究检测的菌株和分离物，它们的CIRM-BP参考号，以及分离培养基的来源直到%汇合，再按前所述方法进行鉴别。通过增加MSP浓度（0.1、0.5、1、5和10mg/ml）培养IPEC-1细胞72h，观察MSP提取物的细胞毒性作用，并用台盼蓝排斥试验测定细胞活力。MSP在浓度1mg/ml时，未见明显的细胞毒性迹象，对细胞增殖没有影响（数据未显示）。因此，在细胞培养14天后，使用浓度为1mg/ml和两个连续的十进制稀释液（1、0.1和0.01mg/ml）在含5%二氧化碳的37°C加湿培养箱中刺激上皮细胞4小时。作为对照，这些细胞也在相同的条件下，用来自:B4大肠杆菌（Sigma-Aldrich,France）的ng/ml脂多糖或培养基处理。

接种物的制备每菌株的单个24小时菌落悬浮在无菌生理盐水（0.85%氯化钠）中，并将细菌悬浮液浓度调整为等于0.5号麦氏比浊度标准管（McFarland）。使用nm的分光光度计对每个微生物悬浮液进行标准化，使其在0.5号麦氏比浊度标准管上匹配，相当于1×cfu/ml，然后进行1/10稀释至最终浓度cfu/ml。对标准接种物进行了调整，以便每个点检测cfu

抗菌活性的测定MSP提取物的抗菌活性是使用Denley多点接种法(Denley,England)测定的，与其他方法相比，该方法在技术上花费的时间更少，并且允许在同一琼脂板上总共可测试20个菌株。MSP提取物首先溶解在超纯水中，然后进行高压灭菌。对MSP进行两次连续稀释，得到最终浓度为50-0.04mg/mL的MH或用5%的马血清(用于挑剔的细菌)琼脂平板MH。然后将含有cfu（2-5μl标准接种液）的细菌悬浮液接种到含有MSP浓度增加的琼脂平板表面。庆大霉素作为阳性对照，最终浓度为10-0.08m/ml。琼脂平板在37℃培养24小时，记录细菌对MSP的敏感性。最低抑菌浓度（MIC）值确定为培养24小时后完全抑制受试微生物可见生长所需的最低MSP浓度。每种微生物重复三次。

04

IPEC-1细胞培养

IPEC-1细胞的培养和分化未转化的猪肠上皮细胞系IPEC-1来源于新生未哺乳的仔猪小肠(Ganzalez-Vallina等.)，并如前所述生长（Zanello等人年）。简单地说，细胞在添加5%胎牛血清、1%胰岛素转铁蛋白硒（Sigma-Aldrich，法国）、2m/ML谷氨酰胺、5ng/ML表皮生长因子50U/ml青霉素和50mg/ML链霉素（均来自法国因维特罗根）的Mem/Hamf-12培养基（法国因维特罗根）中培养。IPEC-1细胞培养2天，达到%融合的预定时间，然后分化10天。为了进行分化培养，上述培养基进行了改良，省略了胎牛血清，并添加了10-7M地塞米松（SigmaAldrich，法国）。分化培养基每2天更换一次，一经分化，IPEC-1细胞平均密度为4×个/孔。如前所述，IPEC-1细胞的分化通过经跨上皮电阻（TEER）测量和免疫组化进行评估（Zanello等人年）。

IPEC-1细胞刺激IPEC-1刺激，将细胞以3.5×个细胞/孔分三次接种到4.2平方厘米的细胞培养基（孔径0.4μm，BectonDickinsonLabware,France）上，在DMEM/HAMF-12中培养。

05

RNA制备和RT-qPCR分析

RNA纯化和cDNA第一链合成刺激4h后IPEC-1细胞用无菌PBS洗涤三次，总RNA用NuclespinRNA-l试剂盒（Macherey–Nagel,Germany）按照制造商的方案纯化，RNA浓度由nm（OD）处的光密度测定。为了尽量减少样品的变化，我们使用了高质量的RNA，通过使用NanoDrop分光光度计分析（NanoDropTechnologies,USA）和毛细管电泳（Agilent2Bioanalyzer,AgilentTechnologies,USA)计算OD/OD进行评估。一微克总RNA在37℃下在20μl体积中逆转录90分钟，其中含有0.25mMdNTP，2.5μM寡糖、25u/μl的MuMLV逆转录酶在其缓冲液中（Eurogentec,Liege,Belgium）。在93°C下热灭活5分钟后，生成的cDNA在-80°C下储存直到使用。

实时PCR分析实时分析（qPCR）在Bio-RadChromo4（Bio-Rad，美国）上进行，使用MesaGreenQPCRMasterMixPlus进行SyBr分析（Eurogentec，比利时），如前所述（Zanello等人年；Meurens等人年）。简单地说，设计了与免疫应答有关的各种基因和三个管家基因的引物，用CloneManager9软件（ScientificEducationalSoftware,USA）计算了它们的退火温度，并从比利时的Eurogentec购买。正向和反向引物的核苷酸序列（5′-3′）、退火温度和扩增子大小如表2所示。SYBRGreen试验的热循环条件为95°C，持续5min，然后38个循环，在95°C下变性15s，退火/延长45s。每个反应在三次细胞培养中重复进行，重复两次。定量RT-PCR数据使用2ΔΔct方法进行分析，分析目标的数量（标准化为内源性参考并与实验对照组相关）由2-ΔΔct给出（livak等人，年）。在所有qCPR检测中，用标准曲线法同时用羟甲基双烯合酶2（HMBS2）、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1（HPRT-1）和核糖体蛋白l-19（RPL-19）的平均周期定量（Cq）对靶基因的表达水平进行标准化。如前所述，这三个参考基因在IPEC-1细胞系中的稳定表达（Bruel等人，年）。与未经处理的对照细胞相比，结果显示为相对折叠变化（Fc）。

表2引物序列（5′→3′）、引物集退火温度（℃）、预期PCR片段大小（BP）和PubMed数据库登录号

本研究中使用的管家基因以斜体显示

06

统计分析

比较经处理和未经处理的IPEC-1细胞相对信使RNA（mRNA）表达差异的数据用相对值表示。数据表示为重复三次的平均值±S.E.M.表示。由于数据是独立的，且不是正态分布的，因此使用Kruskal-Wallis检验，然后使用GraphPad（GraphPadPrism版本4.00forWindows；GraphPad软件，美国）进行Bonferroni-Dunn试验后平均数比较试验。当p值0.01时，各处理间的统计差异被认为是显著的。

结果

01

MSP提取物的化学成分分析

除盐步骤前后藻类组分的成分分析在“材料和方法”中有详细描述。该化学成分通过元素分析、近似分析、单糖分析和分子量进行，如表3所示。初始MSP提取物中含有30.6%的矿质灰分，推断出的有机物含量为69.4%。主要由碳水化合物和蛋白质组成。经近似分析，推断出的有机物仅鉴定出50%。MSP提取物的糖成分分析产生了无法利用的结果，检测到的糖含量低，标准误差值高，与高盐含量下方法的低再现性相关。超滤后，从样品中除去盐，得到93.4%的样品，通过近端分析（82.5%）确定大部分为有机物，其中58.1%为碳水化合物。糖残基的组成用低标准偏差测定，可占干重的45%，略低于近似分析。观察到的主要残留物是鼠李糖、木糖和葡萄糖醛酸，它们都参与了绿藻硫化多糖的组成，代表了样品中99%的糖。通过比色法和元素分析观察到硫酸盐的存在，表明硫酸化组分的出现，如绿藻硫化多糖。因此，在超滤之前，MSP中估计的糖含量可能主要归因于绿藻硫化多糖。根据测定的中性糖、醛酸残基和硫酸盐基团，绿藻硫化多糖占干物质的27%。MSP提取物经脱盐后，碳水化合物的含量由24%左右（中性残基和醛类残基）增加到58.1%，而对元素组成的相对比例和蛋白质含量常数的影响不大，约为7.5%。这表明高浓度的盐影响近分析，特别是那些在比色分析之前依赖于水解的那些分析。

表3本研究中用于生物活性的低分子量MSP提取物的组成

n.d.未确定

02

MSP抗菌活性及MIC测定

本研究采用多点接种法测定了MSP的抗菌活性谱和对病原菌的MIC值。用于确定细菌对MSP敏感性的MIC值如表4所示。结果表明，MSP在营养琼脂培养基中的MIC值在0.～50mg/ml之间，对被测微生物的生长具有选择性抑制作用。MSP对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制作用。该提取物对12株受试菌株显示出最重要的活性谱，MIC值从0.到6.25mg/ml非常低。多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、猪红斑丹毒丝菌素和猪链球菌是最敏感的病原菌。但同一菌属内不同菌种间MSP的抗菌活性不同。事实上，与猪链球菌相比，产色链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌对MSP活性的敏感性较低。结果还表明，盲肠肠球菌对MSP提取物敏感，MIC值为25mg/ml时，其生长受到完全抑制。最后，我们发现，MSP对牛棒状杆菌、化脓性隐秘菌、所有被检测的大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌以及肺炎克雷伯菌和粘质沙雷氏菌的抗菌活性有限（表4）。

表4海藻硫化多糖提取物对所有受试细菌都有活性。最低抑菌浓度（MIC）确定为MSP制剂（mg/ml）抑制细菌可见生长24小时的最低浓度，并根据其对MSP效应的敏感性进行分类。数据为重复三次的平均值±S.E.M.表示。

03

MSP刺激IPEC-1细胞表达免疫反应介质

用1、0.1和0.01mg/ml浓度培养猪上皮细胞IPEC-1，研究MSP的免疫调节能力。用定量逆转录聚合酶链反应（RTqPCR）分析了一组免疫应答介质mRNA表达的相对定量，结果以表达水平的倍数变化表达。图1显示MSP能显著增加细胞因子和趋化因子mRNA的相对表达，如IL-8(Fc=.53±47.5)、CCL20(Fc=.44±42.5)、TNFα(Fc=82.63±15.8)和IL-1α(Fc=22.96±3.2)。此外，MSP显著增加了IL-6(Fc=30.58±7)、IL-1β(Fc=4.92±1.6)和TGFβ(Fc=4.83±0.7Fc)mRNA的相对表达(p0.01)（表5）。Toll样受体TLR2(Fc=11.29±1.7)和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）mRNA(Fc=3.71±0.8)在分化的多核细胞中加入MSP提取物时也显著升高(p＜0.01)。然而，MSP对IL-10和IL-12细胞因子mRNA、CCL25和CCL28趋化因子以及TLR4受体的相关基因表达无显著影响（表5）。因此，与MSP处理的细胞相比，脂多糖（LPS）没有诱导IPEC-1细胞中任何被检测基因的表达。

图1用海洋硫酸多糖（MSP）提取物刺激分化的猪上皮细胞IPEC-1表达IL8、IL1A、TNFA和CCL20。用不同浓度的MSP（1,0.1,0.01mg/ml）处理IPEC-1细胞4h，将靶基因的表达定义为折叠变化相关对照。数据表示为三次重复测定的平均值±S.E.M.。

表5经1mg/mlMSP处理的极化IPEC-1细胞与未经处理的对照细胞之间靶向免疫介质的相对折叠变化率（Fc）。数据表示为三次重复测定的平均值±S.E.M.

p0.01，统计学显著性水平

NS不显著

讨论

结果表明，MSP对受试微生物的生长具有选择性抑制作用，MIC值在0.～50mg/ml之间。生物活性MSP对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用。多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性曼氏杆菌、猪红斑丹毒丝菌、猪链球菌和盲肠肠球菌是MSP最敏感的致病菌。已知这些病原体会导致乳腺炎、生殖障碍、肺炎和腹泻等疾病，导致牲畜高死亡率和巨大的经济损失（Economou等人年）。因此，MSP是一种潜在的生物活性物质来源，其研究结果为开发天然抗菌剂用于畜禽养殖中抗感染性病原体提供了新的思路。然而，这种抗菌作用的确切机制尚不清楚，需要进一步的研究来阐明MSP的作用。

利用猪肠上皮细胞体外系统（IPEC-1）模拟MSP的口服分布，检测MSP刺激宿主免疫反应的能力，研究MSP的生物学活性。MSP处理极化IPEC-1细胞，可诱导IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα等多种细胞因子mRNA的上调。这些结果表明，MSP可能能够激活肠上皮细胞，产生细胞介导的免疫应答细胞因子，从而启动和增强宿主的保护性免疫应答，并调节黏膜对肠道病原体的免疫（Stadnyk等。年；Oswald等人年；Leppkes等人年）。有趣的是，CCL20（也称为MIP3α）趋化因子也被MSP高度上调。已知CCR6/CL20轴参与了树突状细胞、B和T淋巴细胞的募集，并调节生理和炎症条件下的肠道免疫的几个方面（Williams；Ito等.年）。MSP还诱导TGFβ的mRNA显著增加，提示该提取物可能有效参与IgA体液免疫应答和肠道上皮组织内的抗炎过程调节（Takenoshita等。年；Walia等人年；Stavnezer等人年）。MSP还通过其抑制炎症细胞因子表达的能力，并引导免疫细胞向抗炎表型分化，参与了免疫应答中的转录因子PPARγ的mRNA表达（TyaGi等.年）。类似地，在体外和体内先前的评估表明，海藻多糖提取物发挥了双刃作用，并显示出免疫调节活性，可能在刺激免疫反应或控制炎症方面有潜在的应用（Chen等人。年；Vo等人年）。

从上述体外实验结果评估的抗菌和免疫调节活性表明，MSP提取物中存在活性化合物，可用于生产天然生物活性分子，以提高农场动物对传染病的抵抗力。然而，本研究中评估的MSP提取物并没有被分离，并且观察到的生物活性可以归因于一些需要纯化的化合物。事实上，有充分的证据表明，从藻类生物量转移到液相的生物活性化合物包括多糖、蛋白质、多不饱和脂肪酸、多胺或矿物质（Chonjnacka等人，年）。尽管如此，化学成分分析表明提取物的主要成分是绿藻硫化多糖，这是一种硫化多糖，其结构与糖胺聚糖（由葡萄糖醛酸和碘醛酸残基组成的硫酸化多糖）相似。绿藻硫化多糖的低分子量组分已经在体外和体内模型中证明了其生物活性（Leiro等人，年；qi等人年；AguilarBrise?o等人。年）。该组分被认为是活性的主要候选者，尽管需要进一步纯化样品以进行最终确认。最后，MSP的免疫调节作用不能归因于LPS，因为使用E-Toxate试剂盒进行MSP分析没有显示LPS污染的迹象（数据未显示）。

这些体外数据的生物学相关性需要通过其他方法来确定，如三维细胞共培养（MSP、上皮细胞和免疫细胞）、肠外植体体外培养模型或直接在体内培养。此外，MSP提取物刺激IPEC-1上皮细胞免疫应答的机制和途径尚不清楚。综上所述，我们的研究结果表明，这种MSP制剂可用于动物日粮中，抑制病原菌生长，刺激免疫反应，从而减少畜群感染的发生和抗生素的使用。在目前的研究中，MSP可能成为黏膜疫苗设计中的一种潜在佐剂，以增强免疫细胞的招募和激活，从而提高先天免疫和适应性免疫。

参考文献［略］

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